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熒光檢測知識(shí)普及原理

發(fā)布時(shí)間： 2021-02-04　　點(diǎn)擊次數(shù)： 3483次

很多細(xì)胞實(shí)驗(yàn)都要檢測熒光，為方便大家選擇合適的方法，在此簡單說一下各種熒光檢測方法的特點(diǎn)。不足的地方，歡迎大家補(bǔ)充：
1、流式，優(yōu)點(diǎn)是速度快，非常適合做大數(shù)量統(tǒng)計(jì)，且樣品只被檢測一次，*不用擔(dān)心熒光淬滅的問題。缺點(diǎn)是只能檢測熒光的有無、強(qiáng)度大小，無法提供空間定位信息，無法做熒光定位變化的實(shí)驗(yàn)；由于樣品只被檢測一次，因此無法對(duì)同一個(gè)樣品進(jìn)行連續(xù)觀察。例如，做膜蛋白定位時(shí)會(huì)得到這么一個(gè)結(jié)果——用流式可以檢測出信號(hào)，但是用顯微鏡卻看不到東西，排除儀器和濾光片選擇問題，很可能是核的自發(fā)熒光或非特異標(biāo)記造成流式的假陽性結(jié)果。
2、熒光顯微鏡，剛好與流式互補(bǔ)，可很好地進(jìn)行空間觀察，判斷目標(biāo)蛋白的定位，但是不適合做大流量檢測，估計(jì)沒人能經(jīng)得起時(shí)間的考驗(yàn)。有不同倍率的物鏡選擇，可以使用高倍物鏡看精細(xì)結(jié)構(gòu)，或用小倍率物鏡做少量統(tǒng)計(jì)。與之搭配的CCD和軟件，是系統(tǒng)能否發(fā)揮性能的關(guān)鍵。尤其是CCD，從那么多商品里選一款合適的不容易，需要了解很多知識(shí)否則只能聽別人忽悠。
3、共聚焦，熒光顯微鏡的升級(jí)產(chǎn)品，具有很好的光學(xué)層切效果，能得到很好三維定位信息。但是，如果使用共聚焦的目的僅僅是為你的樣品拍一張靚照，取得一張好看的圖片，就讓人覺得可惜了。共聚焦基本都是全自動(dòng)系統(tǒng)，可隨意定義照明區(qū)域、選擇多個(gè)熒光通路和設(shè)定定時(shí)取圖，所以，做Time-laps、FRAP和FRET有其獨(dú)到的優(yōu)勢。另外，4Pi和STED又是其中的極，具有超高的空間分辨率，只是使用不方便，未必適合做生物實(shí)驗(yàn)。
4、全內(nèi)反射，熒光顯微鏡的另一種升級(jí)產(chǎn)品，屬于近場光學(xué)范疇，只適合且合做膜研究，無法看到胞內(nèi)信息。也是用CCD成像，但是對(duì)CCD的要求更高——個(gè)人甚至覺得對(duì)CCD的要求是沒有上限的。
5、雙光子，另一種共聚焦，因使用長波激發(fā)熒光，故能做深層檢測（突破共聚焦的100微米極限），典型的應(yīng)用是觀察活體腦組織。巨貴無比，國內(nèi)沒有幾臺(tái)，能用上的人不多——就不說了。
6、新推出的高內(nèi)涵藥篩系統(tǒng)，流式和顯微鏡的雜合體，使用電動(dòng)載物臺(tái)，可以自動(dòng)地按預(yù)定程序完成實(shí)驗(yàn)，可做大流量檢測（雖然速度慢點(diǎn)），而且有成像能力，可以判斷定位。前段時(shí)間，國內(nèi)哪裝了一臺(tái)，很多人在吹，但我實(shí)在不知道其中的好處——任何一臺(tái)帶電動(dòng)載物臺(tái)的顯微鏡都可以達(dá)到相似的效果，只要軟件支持——估計(jì)有人賺大發(fā)啦！
從以上的簡介可以看出，只要是熒光樣品，就應(yīng)該都可使用以上儀器檢測（只用TIRF受一些限制）。但是實(shí)際應(yīng)用時(shí)，大家可能會(huì)碰到某些樣品可以使用流式和顯微鏡，但是無法使用共聚焦。為什么？解釋一下：
首先，熒光檢測必須有激發(fā)光照明，染料被特定波長的光照射以后才能發(fā)射熒光。激發(fā)光源有兩種：1）白光（汞燈、氙燈等），然后通過濾光片選擇只通過特定波長的光。如檢測GFP時(shí)，大家能看到藍(lán)光照射在樣品上，因?yàn)镚FP的激發(fā)條件是488nm 光。但是有一點(diǎn)，顯微鏡不可能裝無限多的濾光片，所以選擇是有限的。2）激光，普通的激光器只能發(fā)射特定波長的光，且數(shù)量有限，常見的是405、488、514、543、633等，所以可使用的染料也是有限。因此，大家判定儀器能否滿足你實(shí)驗(yàn)要求，務(wù)必先看看激發(fā)條件是否合適。
其次，在光檢測器（PMT、CCD)前還有一塊濾光片，作用是反射樣品各種散射光，只通過特定波長的熒光，提高信噪比，得到干凈的背景。因此，這塊濾光片也決定了儀器能否滿足你的實(shí)驗(yàn)要求（不用太擔(dān)心，這個(gè)一般和激發(fā)濾光片配套，不會(huì)有太多問題）。而在光譜型共聚焦里，使用的是棱鏡或衍射光柵分光，可以選擇通過任意需要的波段。這對(duì)使用量子點(diǎn)做標(biāo)記的同學(xué)特別有好處！

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